HIDROLISIS FLAVANOID

Senyawa flavonoid terdapat pada semua bagian tumbuhan tinggi, seperti bunga, daun, ranting, buah, kayu, kulit, kayu dan akar. Akan tetapi, senyawa flavanoid tertentu biasanya terkonsentrasi pada suatu jaringan tertentu, misalnya antosianidin adalah zat warna dari bunga, buah dan daun.

Sebagian besar flavonoid alam ditemukan dalam bentuk glikosida, oleh karena itu ada baiknya diketahui bahwa secara umum, suatu glikosida adalah kombinasi antara suatu gula dan suatu alkohol yang saling berikatan melalui ikatan glikosida. Ikatan glikosida pada prinsipnya terbentuk apabila gugus hidoksil dari alkohol beradisi ke gugus karbonil dari gula, sama seperti adisi alkohol ke aldehida yang dikatalis oleh adanya asam menghasilkan asetal.

Pada hidrolisis, glikosida terurai kembali atas komponen-komponennya menghasilkan gula dan alkohol yang sebanding, alkohol yang dihasilkan disebut aglikon. Biasanya, sisa gula dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa, rhamnosa, galaktosa dan gentiobiosa, sehingga glikosida  tersebut masing-masing disebut glukosida, rhamnosida, galaktosida dan gentiobiosida.

Flavonoid dapat ditemukan sebagai mono, di atau tri-glikosida, dimana satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan hanya sedikit larut dalam pelarut-pelarut organik seperti eter, benzen, kloroform dan aseton.

Untuk membedakan aglikon dan gula yang terikat sebagai glikosida, perlu dilakukan hidrolisis dapat dengan asam, enzim atau basa.

1. Hidrolisis dengan asam.  Biasanya digunakan dengan asam klorida, gugus gula yang terikat pada  aglikon biasanya berupa ikatan O-glikosida atau C-glikosida. Ikatan C-glikosida, sangat tahan terhadap pengaruh asam, sehingga dapat dibedakan antara C-glikosida dengan O-glikosida dengan melihat waktu atau lama hidrolsisinya.

Selain kecepatan hidrolisis dengan asam dari glikosida, juga dipengaruhi oleh posisi ikatan gula pada inti flavonoid. Gula yang berikatan pada posisi 3 dari flavonoid akan lebih mudah dihidrolisis dibanding pada posisi 7, sedang paling mudah dihidrolisis adalah pada posisi 5. Flavonol  3-rhamnosifuranosida kurang stabil sehingga hidrolsis lebih cepat dibanding flavonol 3-rhamnopiranosida yang relatif lebih stabil.

Cara baku menghidrolisis O-glikosida: Larutan glikosida flavonoid (1mg) dihidrolisis dengan 5 ml HCl 2N : MeOH (1:1) dalam labu alas bulat 25 ml, kemudian drefluks selama 60 menit. Uapkan dengan rotavapour, sisanya kemudian dilarutkan dengan MeOH : H₂O (1:1) sesedikit mungkin. Selanjutnya dikromatografi kertas atau KLT-selulosa, 15% asam asetat, hasil :

- jika telah terjadi hidrolsisi, R_f akan menjadi lebih kecil, flavonoid tersebut adalah suatu O-glikosida, kemungkinan kecil juga sebagai bisulfat atau C-glikosida yang ter-O-glikosida.

- Jika tidak terjadi hidrolisis, glikosida tersebut kemungkinan adalah C-glikosida atau suatu glukoronida

- Jika terjadi hidrolisis sebagian, glikosida tersebut mungkin glukuronida

2. Hidrolsis dengan enzim. Hidrolisis dengan enzim, berguna untuk menentukan sifat ikatan antara gula dan flavonoid (yaitu α atau β).   cara ini  hanya memutuskan monosakarida khas dari flavonoid O-glikosida. Selanjutnya dianalisis dengan KLT, atau KGC untuk mengetahui hasil hidrolosis,

-  β-glukosidase (emulsin), menghidrolsisi β-D-gluksodia dan xilosida, tetapi tidak menghidrolsisi antosianidin glikosida.

-    β-galaktosidase, menghidrolsisi β-D-galaktosida

-    β-glikuronidase, menghidrolsisi β-D-glukuronidase

-   Pektinase, menghidrolsis α-D-poligalakturonida dan α-L-rhamnosida

-   Antosianase, menghidrolsisi sebagian besar antosianidin glikosida

-  Rhamnodiastase, memutuskan sebagian besar oligosakarida secara utuh dari glikisda, terdapat dalam Rhamnus frangula

-   Takadiastase, menghidrolsisi naringenin 7-O-neohesperidosida.

3. Hidrolsis dengan basa. Jarang digunakan untuk menghidrolisis gliksodia flavonoid, tetapi digunakan untuk memutuskan gula secara selektif dari gugus hidroksil pada posisi 7 atau 4’ serta 3-hidroksil. Keselektifan ini kebalikan dari hidrolisis dengan asam. Hidrolsis dengan basa akan melepaskan disakarida dari 7 – hidroksil asal ikatan antara glukosida bukan (1----2). Rutinosida akan terhidrolisis, tetapi 7-O-apiol (1----2) gluksida dan 7-O-neohesperidosida tidak terhidrolsis. Dijaga agar tidak ada kontak dengan udara, sebab banyak flavonoid akan terurai dalam suasana basa jika terdapat oksigen. Kebanyakan 7 – dan 4’ – O – gliksida dapat dipecah dalam waktu 30 enit, beberapa glikosida lain memerlukan waktu dua jam. Pemutusan gula yang terikat pada posisi 4’ secara selektif tanpa mengganggu gula yang terikat pada posisi 7.

Cara: Larutan glikosida (10 – 30 mg) dalam 10 ml KOH 0,5% direfluks di atas tangas air selama 30 menit dalam lingkungan N₂. Netralkan dengan HCl 2N dan selanjutnya dikromatografi kertas dengan eluen HOAc 15% untuk mengisolasi flavonoidnya.