ISOLASI FLAVANOID

Metode terbaik untuk mengisolasi atau memisahkan campuran flavonoid antara lain dengan kromatografi kertas (KKt) dan kromatografi lapis tipis (KLT). Jika menggunakan metode KKt, kertas yang disarankan adalah kertas Whatman 3MM (46 x 57 cm) atau yang setara. Kertas dibuat seperti gambar di bawah. Ekstrak ditotolkan kira-kira 8 cm dari tepi lipatan pertama dan 3 cm dari lipatan kedua dengan garis tengah 3 cm yang berpusat pada satu titik. Pengeringan bercak dibantu dengan pengering rambut. Ekstrak yang ditotolkan dapat digunakan secara umum yaitu dari sejumlah ekstrak yang diperoleh dari 50 – 100 mg bahan tumbuhan kering. Elusi pertama dapat digunakan pengembang beralkohol, misalnya BAA (n-Butanol, Asam asetat, Air = BAW) 4:1:5 atau TBA (t-BuOH:HOAc:H₂O) 3:1:1. Kertas diangkat dan dikeringkan di lemari asam, bagian kromatogram yang dilipat (a) digunting. Selanjutnya eluen kedua menggunakan pengembang, biasanya berupa larutan dalam air seperti asam asetat 15%. Untuk antosianin disarankan pengembang setara , biasanya BAA atau Bu/HCl dan kedua HCl 1%.

Flavonoid tidak nampak pada kertas kromatogram, kecuali antosian (bercak jingga sampai lembayung yang menjadi biru dengan uap ammonia), khalkon, auron dan 6-hidroksi flavanol kuning). Karena alasan tersebut, untuk mendeteksi bercak, kromatogram diperiksa dengan sinar UV (366 nm dan 254 nm) dan dapat diperjelas dengan uap ammonia.

Untuk isolasi flavonoid skala besar dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoid (berupa larutan) di atas kolom yang berisi serbuk penjerap (seperti selulosa, silika, atau poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang sesuai. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujungnya dengan ukuran garis tengah berbanding panjang kolom 1:10 atau 1:30.

Mengemas kolom dilakukan dengan hati-hati agar dihasilkan kolom yang homogen. Jika kolom tidak memiliki kaca masir, maka dapat diganakan kaca wol atau kapas, sumbat ini direndam dengan pengelusi yang tingginya kira-kira 10 cm. Kemasan kolom dibuat bubur dengan pelarut yang sama, lalu dituang dengan hati-hati ke dalam kolom tanpa terputus-putus agar tidak terbentuk lapisan. Kemasan dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dibiarkan turun. Jika fase diam poliamida yang digunakan maka dianjurkan untuk mengembangkan dulu satu jam.

Selanjutnya larutan cuplikan ditempat di atas kemasan sedemikian rupa sehingga berupa satu pita, usahakan menggunakan pelarut sesedikit mungkin untuk memperoleh hasil yang baik. Biarkan larutan cuplikan meresap ke dalam kemasan dengan membuka sedikit keran dan setelah cuplikan terbuka, keran ditutup dan ditambahkan perlahan-lahan cairan pengelusi dan dibiarkan kembali meresap ke dalam kemasan.

Memilih kemasan kolom dapat disesuaikan dengan flavonoid yang akan diisolasi sebagai berikut ;

1. Selulosa. Ideal untuk pemisahan antara glikosida atau glikosida dengan aglikon dan aglikon yang kurang polar, selulosa mikrokristal (Merck, Macherey & Nagel dan Whatman CF-11

2. Silika. Baik untuk aglikon yang kurang polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon dan falavonol. Sebaiknya dicuci lebih dahulu dengan asam klorida pekat untuk menghilangkan sesepora besi yang dapat membuat flavonoid terikat kuat pada kemasan. Kiselgel 60, 70 – 230 mesh (merck).

3. Poliamida. Cocok untuk memisahkan flavonoid dan glikosida. Harus dicuci terlebih dahulu dengan matanol dan air untuk menghilangkan poliamida yang larut (dapat mengotori). Polyclar AT General Aniline and Film Corporation), Polyponco 66D Polymer Corporation) dan Polyamida (Woelm).

4. Gel sephadex (deret G). Digunakan untuk memisahkan campuran, terutama berdasarkan atas ukuran molekul (mengunakan pelarut air), molekul besar akan terelusi lebih dahulu. Sangat berguna untuk memisahkan poliglikosida yang berbeda bobot molekulnya. Bila pengelusinya adalah pelarut organik, gel sephadex deret G berprilaku seperti selulosa, tetapi kapasitasnya lebih besar. Gel harus dikembang terlebih dahulu selama 12 jam dengan eluen. Jenis niaga G-10 (untuk bobot molekul 0 – 700) dan G-25 (untuk bobot molekul 100 – 1500)

5. Gel sephadex (LH-20). Dirancang untuk menggunakan pelarut organik, dan dapat digunakan dua cara. Bahan ini menghasilkan eluen tanpa sisa, sangat cocok untuk pemurnian akhir aglikon flavonoid dan glikosida yang telah diisolasi dari kertas, selulosa, silika, atau poliamida. Umumnya pelarut yang cocok adalah MeOH, walaupun pada awalnya diperluka air untuk melarutkan flavonoid, disini gel perlu juga dicuci dengan MeOH.